pengukuran kadar protein dengan metode Bradfrord

Metode Bradford merupakan metode yang paling banyak digunakan karena metode ini lebih cepat dan akurat dalam menentukan kadar protein. Metode Bradford mempunyai sensitivitas empat kali dibanding metode Lowry disamping itu metode lowry sulit menentukan nilai kuantitatif protein dalam larutan standar. Kekurangan lainnya metode Lowry yaitu senyawa-senyawa yang digunakan seperti ion potasium, ion magnesium, EDTA, tris, regen thiol dan karbohidrat mengganggu pengukuran kadar protein.

Metode Bradford melibatkan pengikatan Coomassie Briliant Blue pada protein dan merubah warnanya dari merah menjadi biru disebabkan karena pewarna tersebut diprotonasi oleh gugus amino dari lisin dan triptophan selanjutnya mengikat pada daerah hidrofobik protein sehingga mengubah warnanya menjadi biru. Pengikatan pewarna ini mengakibatkan perubahan absorbansi maksimum pewarna dari 365 menjadi 595 nm. Metode ini sangat cepat dan efisien. Pengikatan protein dengan pewarna terjadi setelah kira-kira 2 menit dan stabilitas warna selama satu jam. Tidak terdapat atau hanya sedikit gangguan dari kation seperti potasium atau karbohidrat seperti sukrosa.

langkah-langkah pengerjaan metode bradford yaitu:

1. Pembuatan Kurva Standar

Kurva standar BSA (Bovin Serum Albumnin) dapat dibentuk dengan cara membuat pengenceran BSA secara berseri dengan konsentrasi pengenceran berseri dan diukur absorbansinya dengan panjang gelombang 595 nm

Konsentrasi Pengenceran Larutan BSA

BSA mg/ml	Stok BSA (ml)	Akuades
0	0	1
0.1	0.1	0.9
0.2	0.2	0.8
0.3	0.3	0.7
0.4	0.4	0.6
0.5	0.5	0.5
0.6	0.6	0.4
0.7	0.7	0.3
0.8	0.8	0.2
0.9	0.9	0.1
1	1	0

2. Pembuatan Reagen Bradford

Reagen bradford dibuat dengan melarutkan 0,025 g Coomasi briliant Blue ke dalam 12,5 ml etanol 95% kemudian ditambahkan 25 ml asam fosfor 85%. Larutan diencerkan dengan akuades hingga mencapai volume 250 ml dan dihomogenkan. Selanjutnya disaring dengan kertas saring dan disimpan dalam botol gelap dan suhu rendah. Sebelum digunakan reagen bradford diencerkan sebanyak 5 kali hingga diperoleh larutan 1 kali pekat.

3. Penyiapan Ekstrak Kasar Enzim

Kedalam Erlenmeyer beriisi 100 ml media NB + 1% pati diinokulasikan 2 lup biakan bekteri lalu diinkubasi selama 18 jam. Biakan tersebut kemudian di sentrifugasi pada 10000 rpm, 4⁰ C selama 10 menit. Supernatan yang diperoleh diambil dan digunakan sebagai ekstrak kasar enzim amilase untuk kemudian diukur kadar proteinnya.

4. Pengukuran Kadar Protein dengan Metode Bradford (1976)

Konsentrasi protein ditentukan dengan menggunakan Bovine Serum Albumin (BSA) sebagai standar. BSA dibuat serial konsentrasi dari 0.1 hingga 1.0 mg/mL. Masing-masing konsentrasi standar protein dan enzim dari Bacillus sp dan B. subtilis diambil sebanyak 0,1 ml dan tabung ditambahkan 5 ml pereaksi Bradford. Campuran dihomogenkan dan diinkubasi pada 37 ºC selama 10 menit kemudian diukur absorbansinya dengan panjang gelombang 595 nm.

Nilai absorbansi dan konsentrasi protein dari standar BSA diplotkan pada grafik dengan konsentrasi protein sebagai absis (sumbu x) dan absorbansi sebagai ordinat (sumbu y), kemudian ditentukan persamaan garis regresinya. Kurva yang terbentuk dijadikan sebagai kurva standar untuk menentukan konsentrasi protein dimana y = nilai absorbansi ekstrak kasar enzim dan x = kadar protein