isolasi RNA total

Asam ribonukleat (RNA) senyawa yang merupakan bahan genetik dan memiliki peran utama dalam ekspresi gen. Dalam dogma pokok (central dogma) genetika molekuler, RNA menjadi perantara antara informasi yang dibawa DNA dan ekspresi fenotip yang diwujudkan dalam bentuk protein. Molekul RNA merupakan polimer panjang yang tidak bercabang dari gugus ribonukleotida monofosfat yang digabungkan dengan ikatan fosfodiester. Monomer RNA disebut nukleotida, strukturnya terdiri atas tiga komponen utama, yaitu pentosa (ribosa atau gula berkarbon 5), gugus fosfat, dan basa nitrogen (purin dan pirimidin). Basa nitrogen berikatan dengan pentosa membentuk nukleosida. Selanjutnya ketika gugus fosfat bergabung dengan nukleosida dengan ikatan fosfodiester maka akan membentuk nukleotida (Farrell 1993). Polimer tersusun dari ikatan berselang-seling antara gugus fosfat suatu nukleotida dengan gugus ribosa dari nukleotida yang lain.

Asam ribonukleotida (RNA) adalah salah satu molekul asam nukleat yang dibentuk oleh asam dioksiribonukleotida (DNA) yang berfungsi untuk mensintesis protein di dalam inti sel. Berdasarkan letak dan fungsinya RNA dibagi tiga, yaitu messenger RNA (mRNA), transport RNA (tRNA), dan ribosome RNA (rRNA). mRNA berfungsi sebagai cetakan dalam sintesis protein. tRNA berfungsi untuk menterjemahkan kode-kode yang dibawa oleh mRNA. Sedangkan rRNA tersimpan dalam ribosom dan berperan aktif dalam proses sintesis protein (Nurhadryani et al 2004).

Secara kimiawi, perbedaan utama antara DNA dengan RNA adalah (1) gugus hidroksil pada RNA bergabung dengan karbon posisi 2 pada gula ribosa sedangkan pada DNA tidak; (2) pada RNA tidak terdapat basa timin tetapi sebagai gantinya adalah basa urasil. Lebih khusus, RNA disusun oleh prekursor ribonukleotida sedangkan DNA disusun dari prekursor deoksiribonukleotida. Selain itu juga secara kimiawi dan biologis molekul RNA lebih tidak stabil dibandingkan dengan molekul DNA, terutama pada suhu tinggi dan dalam keadaan basa (Farrell 1993).

Molekul RNA berperan penting pada ekspresi gen dan biosintesis protein (Koolman et al. 2000). Semua fungsi sel dan jaringan diatur oleh ekspresi gen, oleh karena itu alasan memilih untuk mempelajari atau meneliti RNA sebagai salah satu parameter biokimia seluler adalah karena keragaman populasi intraseluler RNA itu sendiri (Farrell 1993).

Reverse Transcriptase Polimerase Chain Reaction (RT PCR)

Teknik ini merupakan pengembangan dari teknik PCR yang awal mulanya ditemukan oleh Karry B. Mullis pada tahun 1985. Metode PCR adalah suatu metode enzimatis untuk melipatgandakan secara eksponensial suatu sekuen nukleotida tertentu dengan cara in-vitro. Teknik RT PCR merupakan suatu pengembangan dari teknik PCR untuk melakukan analisis terhadap RNA hasil transkripsi yang hanya terdapat dalam jumlah yang sedikit di dalam sel. Teknik RT PCR yang dikembangkan sangat spesifik, sehingga dapat digunakan walaupun jumlah RNA yang akan dianalisis sedikit (Yowono 2006).

Oleh karena PCR tidak dapat dilakukan dengan menggunakan RNA sebagai cetakan maka harus terlebih dahulu dilakukan transkripsi balik (reverse transciption) terhadap molekul RNA sehingga diperoleh molekul cDNA (complementary DNA). Molekul cDNA tersebut selanjutnya digunakan sebagai cetakan untuk proses PCR selanjutnya. Kegunaan teknik RT PCR antara lain adalah untuk mendeteksi ekspresi gen, untuk amplifikasi RNA sebelum dilakukan kloning dan analisis, maupun untuk diagnosis agensia infektif maupun penyakit genetik (Yowono 2006).

Teknik RT PCR memerlukan enzim transkriptase balik (reverse transcriptase). Enzim transkriptase balik adalah enzim yang digunakan untuk mensintesis cDNA dengan menggunakan RNA sebagai cetakan. cDNA yang disintesis akan bersifat komplementer dengan RNA cetakan. Beberapa enzim transkriptase yang dapat digunakan antara lain mesophilic viral reverse transcriptase (RTase) yang dikode oleh virus Avian myoblastosis (AMV) maupun oleh virus Moloney murine leukemia (M-MuL V), dan Tth DNA polymerase (Yowono 2006)

Bahan dan Metode

Bahan

Bahan yang digunakan ialah daun tembakau, nitrogen cair, buffer CTAB, laruran LI, larutan LiCI, TE, larutan PCI, DEPC, MOPS, primer SOD, primer Oligo (dt), dNTP, ddH₂O, RNA, enzim superskrip Reverse Transkiptase, dan DDT.

Metode kerja

Isolasi RNA Total

Sampel daun tembakau sebayak 0.5 gram digerus dengan menggunakan mortar dan ditambah nitrogen cair sampai halus. Penggerusan dengan nitrogen cair harus dijaga jangan sampai daun mengeluarkan cairan. Hasil gerusan dimasukkan ke tabung ependorf 1.5 ml yang berisi 0.6 ml buffer CTAB yang sebelumnya telah diinkubasi pada suhu 65°C. larutan ini diinkubassi kemabali pada suhu 65 C selama 15 menit. Setelah itu, masukkan ke es dan setelah dingin ditambahkan 0.6 ml CI dan dikocokkuat. Lalu, disentrifugasi dengan kecepetan 10.000 rpm pada suhu 4°C selama 10 menit. Supernatan diambil dan pindahkan ke tabung ependorf baru dan tambhakan ¼ volume larutan 10 M LiCl dan diinkubasi di freezer selama 1 jam. Lalu disentrifugasi dengan kecepatan 10.000 rpm, 4 C sealam 15 menit. Supernatan dibuang, pellet diresuspensi dengan 500 µl TE. Setelah itu dilakukan ekstraksi dengan 1 x volume phenol pH 9, divorteks dan disentrifugasi dengan kecepatan 10.000 rpm selama 10 menit. Supernatan diambil dan diekstraksi kembali dengan 1 x volume PCI, divorteks dan disentrifugasi pada kecepatan 10.000 rpm, 4 C salaam 10 mneit. Supernaatn diambil dan ditambahkan ¼ volume 10 M LiCl dan diinkubasi di freezer salaam 1 jam. Lau disentrifugasi denagn kecepatan 10.000 rpm, 4 C selama 15 menit. Supernatan dibuang dan ditambahkan 500µl etanol 70 % pada pellet. Lalu sentrifugasi kembaliu denagn kecepatan 10.000 rpm, 4°C salaam 5 menit. Supernatan dibuang dan pellet dikeringkan setelah kering, ditambahkan 30µl air DEPC.

Kuantifikasi dengan Elektroforesis

Kuantifikasi dilakukan dengan elektroforesis menggunakan agarose 1%. Komposisi agarose terdiri atas agarosa sebanyak 0.4 gram, 20 x MOPS 2 ml, formaldehid 2,2 ml dan DEPC 0.1 % hingga 40 ml. Sampel RNA yang akan dielektroforesis diberikan perlakuan yaitu RNA sebanyak 5 µl (10 µg) ditambah premix ( 5% 20x MOPS; 50% formamide; 175% formaldehid; 27,5% depc 0,1%) sebanyak 12µl/sampel kemudian diinkubasi pada suhu 65^o selama 10 menit. Selanjutnya diinkubasi di dalam es selama 5 menit. Kemudian ditambahkan loading dye, dicampur dan dielektroforesis. Buffer yang digunakan dalam elektroforesis adalah bufer MOPS.

Isolasi gen dengan RT-PCR

Teknik RT PCR dilakukan dengan menggunakan primer SOD dengan buffer sebanyak 2 µl, primer Oligo (dt) 500 ng/µl sebanyak 0.5 µl, dNTP (25 mM) sebanyak 1 µl, RNA (500 ng – 5 μg) sebanyak 1 µl, enzim superskrip Reverse Transkiptase sebanyak 0.1 µl, ddH₂O sebanyak 10 µl, dan DTT 0.1 M sebanyak 1 µl. Program RT PCR (pre PCR) terdiri dari predenaturasi 30°C selama 10 menit, denaturasi 42°C selama 50 menit, annealing 95°C selama 5 menit dan elongasi 15°C selama 15 menit. Keberhasilan terbentuknya cDNA dan kemurnian diperiksan dengan PCR.

Keberadaan cDNA diperiksa dengan PCR dengan menggunakan primer dari gen aktin, dengan komposisi sebagai berikut, ddH₂O sebanyak 4.6 µl, dNTP sebanyak 1 µl, Taq DNA polimerase sebanyak 0.5 µl, buffer Taq 0.5 µl, DMSO sebanyak 0.4 µl, cDNA sebanyak 1.5 µl, primer Forward (AF₂) sebanyak 0.5 µl, primer Reverse (AR₂) sebanyak 0.5 µl. Program PCR terdiri dari predenaturasi 94°C selama 5 menit, denaturasi 94°C selama 30 menit, annealing 58°C selama 30 menit, elongasi 72°C selama 60 menit, dan pasca PCR 72°C selama 5 menit. PCR dilakukan sebanyak 30 siklus.